原因不明的特发性血细胞减少和方向不明的克隆造血

来源:白血病·淋巴瘤作者:唐旭东 等时间:2017-08-23 阅读:2741评论:0赞:0 有0人参与

在世界卫生组织(WHO)的造血系统和淋巴组织肿瘤分类中,骨髓增生异常综合征(MDS)的定义是以血细胞减少、至少一系造血细胞发育不良、无效造血和向急性髓系白血病(AML)转化的高风险为特征的一组克隆性造血干细胞疾病[1]。MDS的诊断基于2个特征,病态造血和克隆造血。病态造血是病理学术语,用于描述伴1系或以上血细胞系列形态学异常[1]。这些异常反映了潜在的病理生理变化。骨髓病态造血是WHO定义MDS的核心。但是,MDS中检测到的绝大多数染色体异常或基因损伤不是特异性的。文章讨论了MDS诊断的相关问题,以及达不到MDS诊断标准的处理。

1 MDS的病理生理学概念

根据当前对于MDS生物学的理解,不成熟造血干细胞的体细胞突变具有生存和生长优势,这引起克隆扩增。当骨髓增生不良的克隆成为优势克隆,异常分化/克隆造血祖细胞和前体细胞增多,MDS就会出现临床症状。然后,亚克隆驱动突变导致亚克隆的扩增,最终转化为急性白血病[2]。

最近的研究指出,正常志愿者的造血干/祖细胞随着年龄的增长会累积随机突变。绝大多数突变是一过性事件,几乎所有的事件中,只需1个或2个协同突变就可产生恶性克隆[3]。根据这一工作模型,涉及MDS造血祖细胞功能丧失的体细胞突变在干细胞水平意味着获得功能。或者,病态造血可能源于优势扩增的体细胞突变和分化/成熟缺陷的结合。

大约一半的MDS患者可以出现重现性染色体异常。但除了del (5q)以外,这些好像都是继发的遗传学事件,是由于基因突变引起的基因组不稳定性造成的。近年有研究发现了几个基因中的重现性体细胞突变,包括RNA剪接(SF3B1、SRSF2、U2AF1、ZRSR2)、DNA甲基化(TET2、DNMT3A、IDH1/2)、组蛋白修饰(ASXL1、EZH2)、转录调控(RUNX1)、DNA修复(TP53 )、信号转导(CBL、NRAS、KRAS)和黏连蛋白复合物(STAG2 )。只有4~ 6个基因在10%或以上的MDS患者中持续表达,而有约40个基因表达次之[4,5,6]。

2 伴病态造血的髓系肿瘤的诊断和分型标准

MDS的诊断方法包括外周血、骨髓涂片评价形态学异常,骨髓活组织检查评价骨髓细胞结构、分布和纤维化;细胞遗传学来确认非随机的染色体异常。其他包括免疫分型和荧光原位杂交(FISH)等也是推荐的[7]。

根据WHO的分类标准,MDS的分类依据是病态造血的细胞系列、铁粒幼细胞的存在、骨髓和外周血的原始细胞比例。WHO的分型标准对于伴病态造血的髓系肿瘤提供了最好的诊断方式。但WHO从2001年开始推出此标准就存在缺陷。事实上,确认病态造血细胞比例和铁粒幼细胞的标准还是比较随意。另外,MDS的诊断和分型标准受到病态造血的形态学可重复性差和特异性差的影响[8,9]。很多努力都用来制定形态学参数的标准和细化诊断标准[10,11,12]。尽管如此,单克隆血细胞减少和非血细胞减少对照患者皆可出现形态学异常[8]。此外,病态造血的诊断对于不同研究者的标准一致性很低[13]。

重现性的染色体异常对于MDS的诊断有重要意义,因为其提供了克隆扩增的标记。几种最常见的核型异常,如+8、del (20q)和-Y,其实与MDS并没有特异性的关系[1]。相反,根据WHO 2008标准,几种特殊的染色体核型异常被用于诊断MDS,甚至在没有形态学特征支持的情况下也是如此。尽管其只占MDS的极少部分,但是至少说明,病态造血并不是诊断MDS的必备条件。

3 意义不明的特发性血细胞减少(ICUS)

在缺少形态学或无细胞遗传学异常的情况下,排除或是明确MDS的诊断极具挑战性。另外,在疾病早期诊断MDS的病例明显增多,而此时骨穿并未显示明显的病态造血[11]。为了描述可疑但未确诊的MDS,引入了ICUS的概念。ICUS的定义如下:一系或以上血细胞减少(血红蛋白<110 g/L,中性粒细胞计数<1.5×109/L,血小板计数<100×109/L)最少6个月,除外其他疾病,而且达不到MDS的诊断标准。要诊断ICUS,必须排除引起血细胞减少的其他疾病,而且要对照MDS的诊断标准。这些患者需要密切观察,反复进行包括骨髓穿刺等的检查来确诊。

尽管目前对于ICUS的诊断,其阐述很明确,但这个定义有内在局限性。事实上,在明确诊断之前需要有一段合适的观察期,甚至是短暂时间的持续血细胞减少。另外,必须承认,不同于其他意义不明的血液系统疾病,如意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)或单克隆B细胞淋巴细胞增多症,ICUS的诊断不需要克隆异常的证据。

文献报道的有关ICUS的回顾性研究有限,而且其研究结论存在矛盾和争议[14,15,16]。造成这一结果的原因可能是由于ICUS的诊断标准尚不完善,随访没有进行监督。需要进行更大规模的ICUS的前瞻性研究,来明确其长期预后及向MDS或其他血液系统疾病发展的趋势。

近年来,大量的努力都在为精确诊断MDS提供更新的诊断工具,包括流式细胞术的免疫分型等[17]。根据现有研究,流式细胞术对于MDS的检测敏感度为60 %~98 %,特异度为93 %~100 %[18,19,20,21]。另外,在初诊没有足够的MDS诊断依据时,流式细胞术的诊断敏感度在最终诊断为MDS的患者中提高至76 %[20,22] ,并与非特异性相当。目前流式细胞术检测在伴形态学轻微异常的患者中具有高敏感性。

4 MDS基因谱的临床暗示

重现性体细胞突变的认定,或提供客观和重现性的克隆标记,或标识生物学同质性,而不管形态学诊断标准,可能暗示伴病态造血的髓系肿瘤的诊断。在MDS的亚型中,唯一以遗传学异常命名的是del (5q)综合征[1,23]。最近,在基因型-表型关系上的巨大进展是在伴铁粒幼细胞的MDS患者发现SF3B1的体细胞突变[24,25]。SF3B1突变证实在98%的伴铁粒幼细胞MDS患者中提示预后良好,而不论这类患者的铁粒幼细胞是否达到15%的诊断标准,这提示以前以15%作为铁粒幼细胞的标准并不准确[23,26]。目前证据提示,以遗传学异常为基础的MDS亚型的命名有助于预测一组患者的预后。另外,近期研究显示,约90 % MDS患者伴1个或以上致癌突变[4,5,6]。尽管大多数在MDS发现的基因突变也会出现在其他髓系肿瘤,但这些基因突变的发现提供了MDS可疑患者存在克隆异常的证据。

5 方向不明的克隆造血(CHIP)

造血细胞存在累积突变和随年龄增长髓系肿瘤发生风险提高的证据,促使研究者们通过大规模基因测序筛查健康人群中的髓系肿瘤突变基因。

在20世纪90年代,检测女性X染色体失活形式的标志性研究发现血细胞存在与年龄相关的偏倚[27]。Busque等[28]报道,TET2突变在大多数伴X染色体失活形式的人群中表达时,这一人群不会发生肿瘤。提示以一个起始基因突变驱动的细胞扩增导致的造血克隆出现,只是造血系统衰老的一种表现形式,而且这些造血克隆代表一种癌前病变形式。

最近,3个大规模研究提供了与年龄相关的造血克隆证据,这些造血克隆也是髓系肿瘤的常见突变形式,其受基因突变驱动,与出现血液系统肿瘤风险提高有关[29,30,31]。Xie等[29]的研究对2 728例肿瘤基因图谱的非血液系统肿瘤患者的外周血进行分析,发现重现性的血液特异性肿瘤相关基因突变的表达,这些突变绝大多数与老年人相关。而且,绝大多数基因突变是重现性的白血病和(或)淋巴瘤相关的基因突变,包括DNMT3A、TET2、JAK2、ASXL1、TP53和SF3B1。随后的2个队列研究分析了12 380和17 182例患者的外周血细胞DNA,这些患者并没有区分是否患有肿瘤或血液系统疾病。研究结果同样提示随着年龄增长,克隆性体细胞突变增加。血液系统恶性肿瘤涉及的基因突变在70~ 79岁人群中的比例大于10%,在90岁及以上人群中的比例为20%[29,30,31]。

表观遗传调控涉及的可检测到的克隆扩增主要是3个体细胞突变基因:DNMT3A、TET2和ASXL1。另外,髓系肿瘤相关的其他基因,包括JAK2、SF3B1、SRSF2和TP53,其突变的比例较低[29,30,31]。而且,很多时候发现,克隆造血并不能找到其驱动突变的候选基因[30]。大多数患者经过检测只有一个基因突变,说明这些患者可能只在一开始受到一次基因损伤。另外,已知突变的等位基因突变分数的中位数为9.0%~19.5 %,提示这些突变只存在一个血细胞的亚群中[29,30,31]。一个更新的研究对健康人和随机人群进行超深测序,探讨了髓系肿瘤相关的15个基因位点的热点突变基因。正如以前的研究一样,发现DNMT3A突变最常见。而且仅在70岁及以上人群中发现剪接因子的SF3B1和SRSF2的突变[32]。

伴克隆造血的人群,其患血液系统肿瘤的风险比未发现体细胞突变的人群高13个百分点。这一风险在伴等位基因突变分数为0.10或以上的患者明显增加[30,31]。总之,这些患者每年进展为血液系统肿瘤的风险为0.5 %~1 %,这不同于MGUS患者转化为一种浆细胞肿瘤的风险。携带突变与全因死亡率增加有关。血液系统肿瘤引起的死亡并不能完全解释观察到的死亡率增加,而总生存率下降与吸烟和心血管疾病也有关[30,31]。

Jaiswal等[31]研究显示,伴一个或多个基因突变的患者与没有基因突变的患者相比,其外周血的血红蛋白、白细胞和血小板没有明显差别。而在伴基因突变患者中,红细胞分布宽度(RDW)显著增高。此外,伴多系血细胞减少的患者更有可能伴有基因突变,而在贫血患者中,伴有基因突变的患者患原因不明贫血的比例更高。总之,这些数据说明,大多数观察到的基因突变没有明显影响造血细胞的分化和成熟,但是至少一部分突变或协同突变基因可能导致了造血紊乱。CHIP目前定义那种未明确诊断为肿瘤,但是携带与血液系统肿瘤相关体细胞突变基因的状态[33]。

6 伴克隆造血的再生障碍性贫血

获得性再生障碍性贫血(AAA)是以外周血细胞减少和骨髓增生减低为特征一组疾病。再生障碍性贫血(AA)的诊断需要除外其他引起全血细胞减少的疾病,AA特别需要与低增生性MDS相鉴别。缺乏重要的诊断依据可能造成诊断不一致。从理论上说,细胞和分子遗传学可能是区分低增生性MDS和AA的有效准则。但许多研究者提出AA存在克隆造血的证据[34]。事实上,40 %~50%的AAA存在阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)的细胞克隆,PNH是来自造血干细胞的体细胞PIG-A基因突变的结果[35]。此外,AA也发现有一过性细胞遗传学异常。AA的克隆造血与进展为髓系肿瘤的关系仍存在争论。

近来,已经开始应用涉及髓系肿瘤的定向深度基因测序检测AA患者的造血克隆[36,37]。Kulasekararaj等[36]分析了150例不伴MDS形态学异常特征的AAA,检测其中20%患者的体细胞突变基因。绝大多数常见的突变基因包括ASXL1、DNMT3A和BCOR,其突变等位基因负荷的中位数为20 %。与无突变的患者相比,伴体细胞基因突变的患者,其端粒长度更短,转化为MDS的风险更高。

最近,一个大型协助研究对439例AA患者候选基因进行定向深度测序。大约1/3的患者存在髓系肿瘤常见的基因突变。最常见的突变基因包括BCOR/BCORL1、DNMT3A和ASXL1。然而,与髓系肿瘤相比,突变频率具有多样性,PIGA和BCOR/BCORL1突变在AA中更常见。此外,AA突变基因的变异等位基因频率明显降低(平均<10 %)。值得注意的是,DNMT3A或ASXL1突变克隆往往随时间的流逝而增加,而BCOR/BCORL1或PIGA突变克隆更倾向于减少或保持稳定。另外,PIGA和BCOR/BCORL1基因突变与预后良好相关,而其他基因突变提示预后差,更倾向于进展为MDS或AML[37]。

总之,这些研究数据表明,相当多的不伴MDS形态学异常的AA患者具有髓系肿瘤经典的基因突变。然而,特异性突变模式和克隆动力学对异常骨髓环境压力下限制性细胞克隆选择的概念更加支持。

7 从克隆造血到髓系肿瘤的转化模式

多组证据表明,CHIP、伴克隆造血的AA或MDS可能代表了造血克隆向肿瘤转化的不同过程。事实上,一系列基因突变发生在这些疾病中,提示这些突变可能代表肿瘤转化的始动事件。此外,单个个体驱动突变的数目和突变等位基因负荷从CHIP和伴克隆造血的AA到MDS是逐渐增加的,说明这些小的造血克隆可能有进展为髓系肿瘤的潜能或尚处于亚临床阶段。然而,每个特异性突变基因维持造血转化的机制以及影响克隆的外部因素,仍需进一步阐明。

现有的研究认为,一系列突变基因包括DNA甲基化基因(DNMT3A、TET2)或染色体修饰基因(ASXL1)可能引发驱动癌前克隆的扩增,继发损伤[28,29,30,31,36,37,38]。其他协同突变导致造血细胞的转化和肿瘤克隆的扩增。

在年龄相关克隆造血的研究中发现,有一小部分受试者从采样到诊断肿瘤的时间非常短[30],提示检测到的克隆是肿瘤小克隆,其在已经检测到或未检测到的已知克隆突变甚至未知克隆突变驱动下扩增,但在当时分析时仅有微小异常或检测不到血细胞计数异常。

最后,AA的不同突变模式印证了达尔文进化论关于异常骨髓微环境压力下造血克隆进展和生存选择的作用[36,37]。几个实验性证据表明MDS也可能是这一机制。然而,小鼠原发间质功能障碍显示可以促进MDS或AML发生[39]。最近发现,Sf3b1K700E基因突变的敲除导致一种与MDS一致的临床表型,但竞争性增殖测定Sf3b1K700E造血干细胞没有表现出增殖优势[40]。有意思的是,McKerrell等[32]在随机个体中采用超深度测序方法,发现SF3B1和SRSF2突变选择性地出现在年龄70岁或更高龄的患者,这表明与造血系统老化相关的选择压力可能促进了携带这些基因突变克隆的扩增。

8 基因组医学时代诊断不明原因血细胞减少的实用方法

随着大规模平行测序技术的推广,为髓系肿瘤临床治疗提供了良机。尽管关于克隆造血的肿瘤潜能和意义的相关问题仍有待说明,但是基因测序在鉴别克隆性病态造血、非克隆性血细胞减少、由于衰老或其他原因导致的获得性骨髓衰竭相关的克隆造血等方面是非常有价值的。

一些研究指出,老年人贫血的患病率高,其中大约1/3的患者,贫血原因不能确定(原因不明的贫血或血细胞减少)。目前,这些患者应进行密切监测和包括骨髓检查等在内的仔细检查,直到诊断明确为止。当贫血/血细胞减少的原因不明,对外周血DNA进行重现性体细胞突变筛查可能是有价值的。事实上,如果未检测到最常见的驱动基因突变,便可提示避免或至少延迟骨髓检查。现有的研究发现一部分MDS患者并未检测到已知的驱动突变[4,5,6],有部分患者仅伴有克隆造血和未知驱动突变[30],这提示这部分患者应进行仔细随访。而伴克隆性血细胞减少证据的患者应进行骨髓检查来除外MDS的诊断。当然,即使在缺乏特征性形态学变化情况下,对于突变和骨髓形态学检查的关联性研究将有助于确定特异性突变或突变模式,用来作为诊断MDS的依据。

尽管关于克隆造血的研究表明,伴有突变的患者每年进展为血液肿瘤的风险约为1 %[31],目前对于不伴血液系统异常的随机患者进行筛查似乎为时过早。但必须承认,只有包括详细血液学检查和仔细随访的前瞻性研究,才能证实对疑似MDS患者进行基因突变筛查的诊断价值。

唐旭东 张路 唐玉凤 王德秀


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