【外刊选译】轻度持续生理性高血糖损害正常糖耐量个体的肝胰岛素敏感性

文章来源：中华内分泌代谢杂志,2019,35(10): 893-897.

作者：韦怡超 胡予

一、引言

吸收后高血糖主要反映内源性(肝)葡萄糖生成(EGP)，并且是伴有空腹血糖升高(>140～160 mg/dl)的2型糖尿病的特征。对于正常糖耐量者，糖原分解和糖异生在内源性葡萄糖生成过程中起到的作用是基本相等的。在控制较差的2型糖尿病患者中，吸收后高血糖主要是肝糖异生增加导致的。尽管在轻度空腹高血糖的糖尿病患者中可能观察不到EGP的绝对增加，但由于胰岛素对EGP的抑制受损而产生的肝胰岛素抵抗是很明显的。在糖尿病前期的个体中，空腹状态下糖异生增加以及胰岛素对糖异生和糖原分解抑制作用受损的现象均表明这些代谢缺陷在2型糖尿病自然病程的早期即存在。

慢性高血糖加重骨骼肌的胰岛素抵抗，血浆葡萄糖浓度恢复正常则使骨骼肌对葡萄糖的摄取得到改善。在2型糖尿病动物模型中，纠正高血糖使肝胰岛素敏感性恢复正常。多种因素参与了2型糖尿病中肝胰岛素抵抗的发展，包括脂毒性和糖毒性。氨基己糖水平升高也被认为是导致肝胰岛素抵抗的一种可能机制。与此一致的是，输注氨基葡萄糖会诱导肝胰岛素抵抗，而且在糖尿病动物模型中通过药物干预降低葡萄糖水平能够改善肝胰岛素抵抗。在体外培养的肝细胞中，葡萄糖和氨基葡萄糖都能通过叉头蛋白O1(FoxO1)的O-糖基化上调葡萄糖-6-磷酸酶。这些在啮齿动物中进行的研究表明，糖毒性在肝胰岛素抵抗的发展过程中起重要作用。

尽管急性高血糖会抑制内源性葡萄糖产生，但人体内慢性高血糖对肝脏胰岛素敏感性的影响在此前还未被研究过。在本研究中，我们探索了有或无2型糖尿病家族史(FH)的正常糖耐量个体中持续生理性高血糖(类似轻度2型糖尿病患者)对基础肝葡萄糖生成(HGP)以及胰岛素对HGP抑制作用的影响。之所以将有阳性家族史的患者纳入本研究，是因为我们之前的研究已表明他们更易受到各种导致2型糖尿病的代谢信号影响，尤其是脂毒性的不良影响。

二、方法

1．受试者：

参与本项研究的是有糖尿病家族史(n＝8)和没有糖尿病家族史(n＝8)的正常糖耐量者，他们的临床特征见表1，受试者均没有服用任何已知影响糖代谢的药物。根据病史、体格检查、血检筛查以及心电图检查，认为所有受试者一般健康状况良好。所有受试者的体重至少在研究前3个月中保持稳定(±3磅)，且没有受试者参与超负荷运动计划。阳性家族史定义为至少2名一级亲属患有2型糖尿病。所有研究均在德克萨斯州圣安东尼奥Audie L. Murphy医院南德克萨斯州退伍军人医疗保健系统的Bartter研究所(BRU)进行。

参照美国糖尿病协会标准，所有受试者均进行75 g口服葡萄糖耐量试验，作为存在正常糖耐量的记录。在试验前30 min、15 min、试验0 min以及之后每15 min直至2 h获取血标本，以测定血浆葡萄糖、胰岛素、C-肽和游离脂肪酸浓度。记录体重(精确到0.1 kg水平)和身高(精确到1 cm)。通过双能X线吸收法测定总体脂量和体脂百分比(4500 Hologic，马萨诸塞州贝德福德)。

2．研究方法：

基线时，所有受试者均接受三阶段高胰岛素正葡萄糖钳夹试验(10、20和40 mU·m^－2·min^－1)，使血浆胰岛素水平上升约20、40和80 μU/ml。每个阶段持续90 min。早上7∶00开始进行胰岛素钳夹试验，之前隔夜禁食约10 h。胰岛素钳夹试验前一晚10∶00，首批招募入组的6例患者喝下²H₂O，按1.6 g/kg体内含水量计算，1 h内分次给药，以对糖异生进行定量。早上7∶00，受试者到BRU报到，开始3-³H-葡萄糖初始剂量(40 μCi)连续(0.4 μCi/min)输注，整个研究270 min持续输注以对HGP进行定量。为了测定C2和C5重氢标记的葡萄糖富集，分别在－120、0、90、180和270 min采集血样。为测定血浆滴定葡萄糖比活性，分别在－30、－20、－10、－5和0 min以及三阶段高胰岛素正葡萄糖钳夹试验过程中每10到15 min采集血样，以计算肝糖生成率、HGP占糖异生百分比以及总糖异生率。²H₂O处理的受试者在约6周时回到BRU(使²H₂O洗脱)，并接受可变剂量的葡萄糖输注以使血浆葡萄糖浓度提升约40 mg/dl，持续48 h。没有接受²H₂O处理的受试者在3～5 d内回到BRU并进行48 h的葡萄糖输注。在第3天早晨，按照前述方法使用3-³H-葡萄糖和²H₂O重复进行三阶段正葡萄糖胰岛素钳夹试验。第3天早上6∶00停止冷葡萄糖输注，允许血浆葡萄糖浓度自发降至空腹水平。晨8∶00，重复三阶段正葡萄糖胰岛素钳夹试验。

3．分析测量：

血浆葡萄糖浓度通过葡萄糖氧化酶反应测定(葡萄糖氧化酶分析仪，Beckman公司，加利福尼亚州富勒顿)，血浆胰岛素和C-肽浓度通过放射免疫法测定(CoatACoat；诊断设备公司，加利福尼亚州洛杉矶)，血浆糖原浓度通过放射免疫法测定(Linco研究公司，密苏里州圣查尔斯)。血浆3-³H-葡萄糖放射性通过Somogyi法测定。血浆葡萄糖C2和C5的重氢富集通过之前描述过的方法进行测定。

4．统计学处理：

使用SPSS软件2.2版本(IBM公司，纽约州阿尔蒙克)进行统计学分析。数据以Mean±SEM表示。通过ANOVA和Bonferroni事后校正对48 h葡萄糖输注前后的变量进行比较。使用Pearson相关系数进行相关性分析。P<0.05表示有统计学显著性差异。

5．计算：

在吸收后稳态情况下，内源性葡萄糖显现基础率等于3-³H-葡萄糖输注率除以稳态血浆滴定葡萄糖比活性。在胰岛素钳夹试验中，存在3-³H-葡萄糖比活性非稳态情况，此时葡萄糖显现率根据Steele公式计算。胰岛素钳夹试验中剩余EGP率通过从示踪剂得出的葡萄糖显现率减去外源性葡萄糖输注率来计算。胰岛素刺激下总葡萄糖清除(TGD)率的计算通过将剩余EGP率与外源性葡萄糖输注率相加得到。糖异生率的计算通过血浆C5/C2葡萄糖比乘以EGP率得到。糖原分解率通过将EGP率减去糖异生率计算得到。

三、结果

1．血浆葡萄糖、胰岛素、C-肽以及胰升糖素浓度：

由于家族史阳性组和家族史阴性组的结果是重叠的，为了便于表达我们将结果进行了合并。平均空腹血糖浓度为(97±2)mg/dl，在48 h葡萄糖输注期间，血糖浓度维持在(136±4)mg/dl。48 h葡萄糖输注期间，血浆胰岛素浓度逐渐从(10±1)μU/ml升至(68±7)μU/ml(P<0.005)。在重复正葡萄糖胰岛素钳夹试验前，经过48 h持续高血糖状态后，血浆葡萄糖浓度[(135±5)mg/dl]被允许回落到空腹水平[(96±3)mg/dl]，此时血浆胰岛素浓度[(17±2)μU/ml，P<0.05]仍高于基线胰岛素钳夹试验当日。需要注意的是，在胰岛素钳夹试验前，血浆葡萄糖和胰岛素浓度以及血浆3-³H-葡萄糖比活性均处于稳态。在48 h葡萄糖输注期间，空腹血浆C-肽水平也显示了与胰岛素相同的趋势[(2.8±0.3)对(1.86±0.2) ng/ml，P<0.05]。48 h葡萄糖输注后，胰岛素钳夹试验三个阶段的稳态血浆胰岛素浓度更高(图1A)。

2．胰岛素钳夹试验中血浆葡萄糖和胰岛素浓度以及胰岛素代谢清除率：

基线胰岛素钳夹试验三阶段的稳态血浆胰岛素(图1A)和葡萄糖水平分别为(25±1)、(51±4)和(87±3)μU/ml，以及(97±3)、(98±2)和(99±2)mg/dl。葡萄糖输注48 h后重复进行的胰岛素钳夹试验中，稳态血浆胰岛素和葡萄糖浓度分别为(37±3)、(67±5)和(116±7)μU/ml以及(99±2)、(96±2)和(97±3)mg/dl。48 h葡萄糖输注前和后进行的正血糖胰岛素钳夹试验三阶段中，血浆胰岛素浓度的增量在40 mU·m^－2·min^－1阶段显著增加。基线时进行的胰岛素钳夹试验三阶段(10、20和40 mU·m^－2·min^－1)过程中，胰岛素代谢清除率分别为(82±5)、(66±4)和(65±3)ml·m^－2·min^－1。在48 h持续高血糖后，胰岛素的代谢清除率为(71±9)(P＝不显著)、(60±7)(P＝不显著)以及(49±4)(与基线相比，P<0.05)ml·m^－2·min^－1。

3．TGD率：

48 h葡萄糖输注前后进行的三阶段胰岛素钳夹试验中每个阶段(10、20和40 mU·m^－2·min^－1)的TGD率在FH＋和FH-受试者中是相同的。在胰岛素钳夹试验40 mU·m^－2·min^－1阶段(图2)，葡萄糖清除率除以稳态血浆胰岛素浓度显著下降[(6.71±0.79)对(12.1±1.04)mg·kg_ffm^－1· min^－1每μU/ml，P<0.005]。将葡萄糖清除率除以稳态下血浆胰岛素浓度增量时，结果也是同样的。在胰岛素钳夹试验40 mU·m^－2·min^－1阶段，TGD/Δ稳态下血浆胰岛素浓度为(8.1±0.9)对(14.7±1.2)mg·kg_ffm^－1·min^－1每μU/ml(P<0.005)。

4．EGP：

在基线胰岛素钳夹研究中，EGP基础率在FH＋和FH-受试者中是相同的。经过48 h葡萄糖输注，EGP基础率在FH-组[从(1.97±0.1)到(3.5±0.5)mg·kg^－1· min^－1, P<0.01]、FH＋组[从(2.1±0.1)到(2.55±0.25)mg·kg^－1·min^－1, P<0.05](图3)以及2组合并后[从(2.04±0.08)到(3.06±0.29)mg·kg^－1·min^－1，P<0.005，图1C]出现同样的显著增加。在正葡萄糖胰岛素钳夹试验各阶段，EGP逐渐降低，在10 mU·m^－2·min^－1阶段观察到了抑制受损(P<0.01，图1B)。由于48 h葡萄糖输注后空腹血浆胰岛素浓度显著上升，葡萄糖输注后，肝脏胰岛素抵抗指数(基础EGP×空腹血浆胰岛素)在FH-组(从16.8±2.2到54.7±11，P<0.001)、FH＋组(从23±2.5到46±7.6，P<0.05，图3B)和2组合并后(从20.1±1.8到51.7±6.6，P<0.001, 图1C)均明显增加。

注：HGP：肝葡萄糖生成

图1 (A)48 h葡萄糖输注之前(基线)和之后进行的胰岛素钳夹试验前和试验三阶段血浆胰岛素浓度；(B)48 h葡萄糖输注之前和之后进行的胰岛素钳夹试验三阶段HGP；(C)48 h葡萄糖输注之前和之后的基础肝胰岛素抵抗指数(基础HGP×空腹血浆胰岛素浓度)

注：TGD：总葡萄糖清除；SSPI：稳态血浆胰岛素

图2 48 h葡萄糖输注之前和之后进行的正葡萄糖胰岛素钳夹试验40 mU·m^－2·min^－1阶段胰岛素敏感性(TGD/稳态血浆胰岛素浓度)

5．糖异生和糖原分解：

将6例患者血浆葡萄糖C5/C2比乘以EGP基础率，计算糖异生基础率。输注葡萄糖48 h后，C5/C2比趋于从0.54±0.07降至0.45±0.04(P＝不显著)，糖异生基础率未变[(5.58±1.8)对(5.78±2.06)μmol·kg^－1· min^－1]，而糖原分解基础率显著增加[(8.02±1.7)对(10.5±1.3)μmol·kg^－1·min^－1，P<0.05]。因此，EGP和肝胰岛素抵抗的增加主要是糖原分解抑制受损所导致的。

6．血浆游离脂肪酸(FFA)和胰升糖素浓度：

为了深入探究葡萄糖输注48 h后肝胰岛素抵抗的发生机制，我们测定了血浆FFA和胰升糖素浓度。基线血浆胰升糖素浓度在输注葡萄糖48 h后有升高趋势[(64±3)对(77±8)pg/ml，P＝0.25，图4]，而血浆胰升糖素产物和胰岛素浓度则显著增加(540±56对1 336±262，P＝0.004)，提示胰岛素对胰升糖素分泌的抑制效果受损。基线血浆FFA浓度在输注葡萄糖48 h后显著降低，并且在胰岛素钳夹试验的三个阶段均被抑制到相同程度(图4)。

注：FH＋：有2型糖尿病家族史；FH－：无2型糖尿病家族史；HGP：肝葡萄糖生成；FPI：空腹血浆胰岛素

图3 (A)基线研究(黑色条块)和48 h葡萄糖输注后进行的研究(灰色条块)中FH＋和FH－受试者基础肝葡萄糖生成；(B)48 h葡萄糖输注之前(黑色条块)和之后(灰色条块)FH＋和FH－受试者的基础肝胰岛素抵抗指数(基础HGP×空腹血浆胰岛素浓度)

图4 48 h葡萄糖输注之前和之后的(A)血浆胰升糖素浓度和(B)血浆游离脂肪酸(FFA)浓度

7．血浆乳酸、丙氨酸和甘油：

血浆乳酸、丙氨酸和甘油是糖异生的关键底物。尽管血浆FFA在输注葡萄糖48h后被显著抑制，但血浆甘油浓度没有明显差异[(13.4±1.2)对(13.3±2.2)mg/L, P＝不显著]。输注葡萄糖48 h后，血乳酸[(1.05±0.05)对(1.48±0.07)mmol/L, P<0.05]和丙胺酸[(2.38±0.3)对(3.32±0.3)mmol/L, P＝0.03]浓度均有小幅增加。

四、讨论

目前结果显示仅仅48 h的轻度持续生理性高血糖即可导致严重的肝脏胰岛素抵抗和内源性(主要反映肝脏)葡萄糖生成基础率的增加。这个现象有重要的临床意义，提示轻度持续高血糖加重肝胰岛素抵抗，且能加重2型糖尿病患者的空腹高血糖。

本实验室和其他团队的研究均表明空腹高血糖(血糖>140 mg/dl)主要是由肝胰岛素抵抗和肝葡萄糖生成基础率的增加导致。在健康个体中血糖浓度的急性增加抑制肝糖生成。相反的是，目前的结果表明在48 h持续性生理高血糖后正常糖耐量(NGT)个体出现了显著的肝胰岛素抵抗，导致肝葡萄糖生成基础率显著增加以及胰岛素对HGP抑制受损(图3)。本研究和之前研究的主要区别是高血糖的持续时间。在之前的研究中，高血糖仅维持了6 h，而在本研究中高血糖维持了48 h。我们没有测定急性高血糖对EGP的影响，因此目前的结果与之前的没有冲突。在健康个体中，急性高血糖诱导的EGP抑制被部分归因于葡萄糖诱导的血浆FFA浓度下降，继发于脂肪分解的抑制。在本研究中，与我们期望的一致，血浆FFA浓度在输注葡萄糖48 h后显著降低。正是这一变化减弱(而不是增加)了葡萄糖诱导的肝脏胰岛素抵抗。

在NGT个体中，约一半的HGP来源于糖原分解，另一半则来自糖异生。在2型糖尿病患者中，隔夜禁食后HGP基础率的增加主要来自肝糖异生的增加。在本研究中，尽管不显著，但葡萄糖输注48 h后来自糖异生的葡萄糖(葡萄糖C5/C2比)有轻微减少。当乘以HGP基础率后，糖异生的绝对率没有显著变化。因此，从量化观点来说，糖原分解率的增加才是HGP基础率增加的主要原因。

至于糖异生，底物到肝脏的传递是肝糖异生的重要决定因素。在本研究中，48 h葡萄糖输注后循环中丙氨酸和乳酸水平轻度增加，而血浆甘油浓度没有改变。尽管血浆丙氨酸和乳酸水平在48 h葡萄糖输注后有所增加，但增量很小，更重要的是，糖异生率没有增加。FFA不是葡萄糖的前体，但是血浆FFA水平升高能够通过活化参与糖异生的酶类以及刺激糖原分解来刺激肝糖异生。然而，本研究中血浆FFA水平在葡萄糖输注48 h后出现显著下降。

氨基己糖流量的增加诱导肌肉、脂肪细胞和肝脏对胰岛素的抵抗，该效应是通过增加细胞内尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺水平来实现的，而该物质最终与胞质蛋白丝氨酸/苏氨酸残基O连接。这种效应被称为糖毒性。尽管在本研究中没有测定，TRIB3被认为参与了葡萄糖介导的肌肉胰岛素抵抗。在2型糖尿病啮齿动物模型中，用肾葡萄糖转运抑制剂纠正高血糖能使肝脏对胰岛素的敏感性恢复正常，降低升高的肝糖异生基础率，以及抑制葡萄糖-6-磷酸酶。相反，在正常小鼠中葡萄糖胺的输注可诱导肝胰岛素抵抗，并上调葡萄糖-6-磷酸酶。在体外培养的肝细胞中，葡萄糖和葡萄糖胺都能通过FoxO1的O-糖基化上调葡萄糖-6-磷酸酶。当去磷酸化后，FoxO1转位至细胞核，并诱导糖异生关键基因磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶的转录。因此，作为慢性高血糖的结果，氨基己糖流量的增加能够通过FoxO1通路诱导胰岛素抵抗。要证明该机制需要提供48 h葡萄糖输注前后的肝活检，而这在人类中是不可能做到的。

啮齿类动物的研究已表明，持续输注葡萄糖4 d，模拟一种生理性高血糖的状态(血浆葡萄糖浓度约250 mg/dl)，会导致>90%的HGP抑制。然而，在第5～7天持续输注葡萄糖则与HGP显著进行性增加有关，这又导致血浆胰升糖素浓度增加。因此，α细胞胰升糖素分泌的增加是糖毒性的表现，且与HGP增加有关。在本研究中，基础血浆胰升糖素浓度在葡萄糖输注48 h后增加了20%(P＝0.20)。考虑到空腹血浆胰岛素浓度在葡萄糖输注后有所增加，血浆胰升糖素水平的上升提示了对胰岛素抑制胰升糖素效应的抵抗。与此一致的是，血浆胰升糖素产物和血浆胰岛素浓度在输注葡萄糖48 h后增加了2.5倍。因此，血浆胰升糖素水平上升可能对正葡萄糖胰岛素钳夹试验中HGP基础率的增加和抑制受损有部分作用。

尽管在本研究中没有测定，可能有人认为葡萄糖输注48 h会增加肝糖原量，因为葡萄糖能快速结合并激活糖原合成，并抑制糖原磷酸酶。然而，肝糖原浓度慢性增加会抑制糖原合成并激活糖原磷酸酶。因此，当输注葡萄糖48 h后，可以假设肝糖原浓度的增加会激活糖原磷酸酶并加速糖原分解，这可能可以部分解释目前观察到的现象。

在葡萄糖输注48 h过程中，刺激了胰岛素分泌，血浆胰岛素浓度显著增加。我们之前已经表明，尽管维持正常葡萄糖浓度，慢性高胰岛素血症还是能够诱导肝脏以及外周组织的胰岛素抵抗。胰岛素通过下调胰岛素信号通路诱导胰岛素抵抗，这可能在肝胰岛素抵抗和HGP基础率增加以及胰岛素对HGP抑制受损中起作用。关于这点，值得注意的是，在2型糖尿病患者中，高血糖和高胰岛素血症常常同时存在，尤其在2型糖尿病自然病程早期β细胞功能仍保留时。

尽管不是本研究的主要目的，48 h持续高血糖足以诱导外周组织(主要反映在肌肉)的胰岛素抵抗。因此，在胰岛素钳夹试验40 mU·m^－2·min^－1阶段(图2)，胰岛素敏感性(TGD/稳态血浆胰岛素浓度)减少了37%。

尽管我们假设糖尿病家族史阳性的NGT受试者可能对慢性高血糖对肝胰岛素敏感性的损害效应更为敏感，但是FH＋受试者中肝胰岛素抵抗的诱导和HGP基础率的增加与没有糖尿病家族史的患者是相同的。

总而言之，仅仅48 h的持续生理性高血糖状态(葡萄糖水平约升高40 mg/dl)就能在有和无糖尿病家族史的NGT受试者中诱导显著的肝胰岛素抵抗。

参考文献 （略）

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